KỸ THUẬT NHUỘM PAPANICOLAOU

I. NGUYÊN LÝ

Nhuộm Papanicolaou còn được gọi là “nhuộm PAP”, là một loại kỹ thuật tế bào học nhuộm đa sắc, dùng để phân biệt tế bào trên phiến đồ được lấy từ các dịch hoặc từ tế bào bong của cơ thể. Cho đến nay, cơ chế nhuộm của kỹ thuật vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ. Dạng kinh điển của nhuộm PAP gồm 5 loại phẩm màu, được pha thành 3 dung dịch:

– Hematoxylin (phẩm nhuộm bazơ): nhuộm nhân tế bào

–  Orang  G  (gồm  axit  photphotungstic  và  OG-5,  OG-8):  nhuộm  chất keratin có trong tế bào.

– Phẩm EA (Eosin Azure): gồm 3 loại phẩm (EA-36, EA-50, EA-65). Eosin Y nhuộm các tế bào vảy bề mặt, hạt nhân, hồng cầu. Xanh lá cây nhạt SF (Light Green). Ánh vàng dùng để nhuộm bào tƣơng của các loại tế bào khác (tế bào vảy không sừng hóa). Nâu Bismarck Y do không nhuộm thành phần nào nên trong công thức nhuộm hiện tại, một số phòng xét nghiệm đã bỏ đi.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học

2. Phương tiện, hóa chất

– Dung dịch cố định phiến đồ: cồn/ete tỷ lệ 1/1.

– Cồn (50,700, 800, 900, 950, 1000)

– Cồn – axit 0,5% (5ml axit HCl với 1000ml cồn 50 độ).

– Xylen (toluen)

– Nước cất 2 lần

– Lá kính, phiến kính.

– Tủ ấm 370  và 560

– Tủ lạnh

– Điều hòa nhiệt độ

– Tủ hốt phòng thí nghiệm

– Bể nhuộm bằng thủy tinh

– Bể thủy tinh đựng cồn, xy len

– Giá đựng phiến đồ (đứng và nằm ngang)

– Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.

– Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.

– Kẹp không mấu, kéo.

– Giấy lọc

– Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.

– Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

– Nguồn cấp nƣớc chảy.

– Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.

– Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây), bao gồm: Hematoxylin Harris, dung dịch màu da cam (Orange G), hỗn hợp EA50, dung dịch xylen – cồn, dung dịch cồn – ete.

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Cố định

a. Chuẩn bị phẩm nhuộm

Hematoxylin Harris (xem phần nhuộm HE)

Dung dịch màu da cam (Orange G) (có sẵn trên thị trường)

+ Orange G 0,5% trong cồn 95º – 100ml

+ Axit Photphotungstic – 0,015g

Hỗn hợp EA50 (có sẵn trên thị trường)

+ Xanh nhạt – vàng nhạt ( Light Green SF – yellowish) – 0,375 g

+ Nâu BISMARCK Y (Bismarck brown Y) – 0,4 g

+ Eosin vàng nhạt 2,5 g

+ Nước cất vừa đủ 50ml

+ Cồn 96º – 609g

+ Cồn (metanol) tuyệt đối 160g

+ Axit Photphotungstic trong cồn 50º (1,7g/5ml) – 5ml

+ Lithicacbonat bão hòa – 0,5ml

+ Axit acetic lạnh 1ml

Dung dịch xylen – cồn:

+ Cồn etanol tuyệt đối – xylen 40%: tỷ lệ 1/1

Dung dịch cồn – ete

+ Cồn 95º – ete: tỷ lệ 1/1

b. Tiến hành kỹ thuật

+ Phiến đồ được cố định trong cồn – ete: 30 giây

+ Chuyển liên tục trong các bể cồn 80º, 70º rồi 50º, mỗi bể 5 lần nhúng

+ Rửa nƣớc cất

+ Nhuộm trong hematoxylin Harris: 3 – 6 phút

+ Rửa nước cất

+ Nhúng 5 – 6 lần trong dung dịch HCl 0,25%

+ Rửa nƣớc chảy trong 6 phút rồi qua nƣớc cất khoảng 30 giây

+ Chuyển liên tục trong các bể cồn 50º, 70º, 80º rồi 95º: mỗi bể 5 lần nhúng

+ Nhỏ Orange G phủ kín bệnh phẩm: khoảng 1 – 3 phút

+ Chuyển liên tục qua 2 bể cồn 95º: mỗi bể 5 lần nhúng

+ Nhuộm trong hỗn hợp đa sắc “EA50” trong khoảng 1 – 4 phút

+ Chuyển liên tục trong các bể cồn 95º rồi 100º: mỗi bể 5 lần nhúng

+ Khử nước bằng cồn 95° và 100°

+ Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

+ Gắn lá kính bằng bôm như thường lệ

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

– Nhân: xanh xám hoặc tím

– Bào tương tế bào ưa axit: đỏ hồng, đỏ tươi hoặc vàng da cam

– Các tế bào ưa bazơ: xanh nhạt, đôi khi xanh ve nhạt

V. MỘT SỐ SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ

Cần tuân thủ thời gian nhuộm nhân bằng hematoxylin vì nếu không nhân tế bào sẽ rất đậm màu, dễ gây hiện tượng dương tính giả.

Nguồn: Quyết định số 5199/QĐ-BYT ngày 25/12/2013 của Bộ Y tế ban hành tài liệu “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Giải phẫu bệnh- Tế bào học”